Sujet de stage Master 2 (Janvier-Juin 2025)

Laboratoire de Biochimie des Protéines Membranaires (BPM)
Institut de Biologie Physico-Chimique (IBPC), Paris

Etude in situ des pompes d’efflux responsable de la résistance aux antibiotiques chez Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa

Contexte :
La résistance aux antibiotiques chez les bactéries est considérée par l’OMS comme un problème de santé publique majeur, causant plus de 700 000 décès chaque année, un chiffre qui pourrait atteindre 10 millions d’ici 2050. Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli, toutes des bactéries Gram-négatives, sont parmi les six espèces les plus pathogènes pour l’Homme pouvant devenir multirésistantes. Ces bactéries ont développé différents mécanismes de défense contre les antibiotiques dont les pompes d’efflux, des protéines membranaires qui jouent un rôle crucial en capturant les antibiotiques de l’enveloppe cellulaire et en les expulsant hors de la bactérie. Il est aujourd’hui nécessaire de trouver de nouvelles approches pour comprendre ces systèmes et redonner un essor aux études contre la multirésistance. Au laboratoire, nous travaillons sur différentes pompes d’efflux d’Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa.
Malgré les succès récents des nouveaux systèmes d’expression, les protéines membranaires restent difficiles à étudier en raison de leur besoin d’un environnement hydrophobe. Jusqu’à présent elles ont été principalement étudiées en solution en présence de détergents, ou des vésicules lipidiques mimant l’environnement membranaire. Néanmoins ces méthodes peuvent altérer la fonction et la structure de ces protéines. Nous souhaitons donc aller plus loin et accéder aux détails atomiques et fonctionnels des protéines membranaires, plus spécifiquement de nos pompes d’efflux, dans leur environnement natif. Cette nouvelle approche permettra non seulement de mieux comprendre le fonctionnement des pompes d’efflux dans les bactéries, mais apportera un nouvel ou.là la communauté scientifique travaillant sur les protéines membranaires pour leurs études.

Objectif du stage :
Au cours de son stage, l’étudiant(e) sera amené(e) à purifier des vésicules de bactéries dans lesquelles sont exprimées les pompes d’efflux. Suite à cette expression, il/elle sera amené(e) à étudier le transport d’antibiotiques en présence ou non d’inhibiteurs de pompes d’efflux, et la structure de ces dernières par microscopie electronique. L’étudiant(e) développera ainsi une expertise en biochimie des protéines membranaires, microbiologie et biologie structurale. Ce projet transversal, couvrant plusieurs domaines de compétences, lui fournira une formation complète pour sa carrière scientifique, que ce soit dans le domaine académique ou industriel. De plus, l’étudiant(e) travaillera pendant six mois au sein d’une équipe dynamique et stimulante, lui permettant de s’épanouir tant scientifiquement que personnellement.

Profil recherché :
Nous recherchons un(e) candidat(e) ayant de solides connaissances en biochimie et microbiologie. Des connaissances en biologie structurale (notamment la microscopie électronique) seraient appréciées. Le projet s’inscrit dans la perspective d’une thèse.

Contacts :
Merci d’envoyer à Dhenesh Puvanendran (puvanendran@ibpc.fr) et Francesca Zito (zito@ibpc.fr) :
– un curriculum vitae
– une lettre de motivation
– un relevé de notes des 3 dernières années universitaires
Si vous avez la moindre question, n’hésitez pas à prendre contact.

Références :
1) Miroux, B. & Walker, J. E. Over-produc.on of Proteins inEscherichia coli: Mutant Hosts that Allow Synthesis of some Membrane Proteins and Globular Proteins at High Levels. J. Mol. Biol. 260, 289–298 (1996).
2) No .me to Wait: Securing the future from drug-resistant infections. hBps://www.who.int/publica.ons-detail-redirect/no-.me-to-wait-securing-the-future-from-drugresistant- infec.ons.
3) Glavier, M. et al. An.bio.c export by MexB mul.drug efflux transporter is allosterically controlled by a MexA-OprM chaperone-like complex. Nat. Commun. 11, 4948 (2020).
4) Verchère, A., Dezi, M., Adrien, V., Brou.n, I. & Picard, M. In vitro transport ac.vity of the fully assembled MexAB-OprM efflux pump from Pseudomonas aeruginosa. Nat. Commun. 6, 6890 (2015).
5) Yao, X., Fan, X. & Yan, N. Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome. Proc. Natl. Acad. Sci. 117, 18497–18503 (2020).
6) Levental, I. & Lyman, E. Regula.on of membrane protein structure and function by their lipid nanoenvironment. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 24, 107–122 (2023).
7) Arechaga, I. et al. Characterisa.on of new intracellular membranes in Escherichia coli accompanying large scale over-produc.on of the b subunit of F 1 F o ATP synthase. FEBS LeB. 482, 215–219 (2000).
8) Carranza, G. et al. Cardiolipin plays an essential role in the forma.on of intracellular membranes in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta BBA – Biomembr. 1859, 1124–1132 (2017).
9) Royes, J. et al. Bacteria-Based Produc.on of Thiol-Clickable, Gene.cally Encoded Lipid Nanovesicles. Angew. Chem. Int. Ed. 58, 7395–7399 (2019).
10) Pérez-Cruz, C., Delgado, L., López-Iglesias, C. & Mercade, E. Outer-Inner Membrane Vesicles Naturally Secreted by Gram-Nega.ve Pathogenic Bacteria. PLOS ONE 10, e0116896 (2015).
11) Delgado, L., Baeza, N., Pérez-Cruz, C., López-Iglesias, C. & Mercade, E. Cryo-transmission Electron Microscopy of Outer-inner Membrane Vesicles Naturally Secreted by Gram-nega.ve Pathogenic Bacteria. BIO-Protoc. 9, (2019).
12) Pérez-Cruz, C., Briansó, F., Sonnleitner, E., Bläsi, U. & Mercadé, E. RNA release via membrane vesicles in Pseudomonas aeruginosa PAO1 is associated with the growth phase. Environ. Microbiol. 23, 5030–5041 (2021).
13) Zwama, M. et al. Multiple entry pathways within the efflux transporter AcrB contribute to multidrug recognition. Nat. Commun. 9, 124 (2018).
14) Chen, M. et al. In situ structure of the AcrAB-TolC efflux pump at subnanometer resolution. Structure 30, 107-113.e3 (2022).
15) Du, D. et al. Interactions of a Bacterial RND Transporter with a Transmembrane Small Protein in a Lipid Environment. Structure 28, 625-634.e6 (2020).
16) Kanonenberg, K. et al. Shaping the lipid composition of bacterial membranes for membrane protein produc.on. Microb. Cell Factories 18, 131 (2019).